100 ufcml

Paramètre en microbiologie

Pour la cellule hématopoïétique humaine, voir Cellule souche hématopoïétique.

En microbiologie, une unité formant des colonies (UFC, UFC ou UFC ) est une unité qui estime le nombre de cellules microbiennes (bactéries, champignons, virus, etc.) dans un échantillon qui sont viables, capables de se multiplier par fission binaire dans des conditions contrôlées. Le comptage avec des unités formant des colonies nécessite l’élevage des microbes et ne compte que les cellules viables, contrairement à l’examen microscopique qui compte toutes les cellules, vivantes ou mortes. L’aspect visuel d’une colonie dans une culture cellulaire nécessite une croissance importante, et lors du comptage des colonies, il n’est pas certain que la colonie soit issue d’une seule cellule ou d’un groupe de cellules. L’expression des résultats en unités formant des colonies reflète cette incertitude.

théorie

Le but du comptage sur plaque est d’estimer le nombre de cellules présentes en fonction de leur capacité à donner naissance à des colonies dans des conditions spécifiques de température, de temps et de milieu nutritif. Théoriquement, une cellule viable peut donner naissance à une colonie par réplication. Cependant, les cellules solitaires sont l’exception dans la nature, et dans la plupart des cas, l’ancêtre d’une colonie est une masse de cellules déposées ensemble. ^{[1] [2]} De plus, de nombreuses bactéries se développent en chaînes (par exemple, Streptocoques ) ou en amas (par exemple, Staphylocoques ). Pour ces raisons, l’estimation du nombre de microbes par UFC sous-estime le nombre de cellules vivantes présentes dans un échantillon. En effet, le comptage de l’UFC suppose que chaque colonie est séparée et fondée par une seule cellule microbienne viable. ^[3]

L’assiette le nombre est linéaire pour E. coli sur la plage de 30 à 300 UFC sur une boîte de Pétri de taille standard. ^[4] Par conséquent, pour s’assurer qu’un échantillon donnera des UFC dans cette plage, il faut diluer l’échantillon et plaquer plusieurs dilutions. En règle générale, des dilutions dix fois plus élevées sont utilisées, et la série de dilutions est plaquée en répétitions de 2 ou 3 sur la plage de dilutions choisie. Souvent, 100 μL sont plaqués, mais des quantités plus importantes allant jusqu’à 1 mL sont également utilisées. Des volumes de placage plus élevés augmentent les temps de séchage, mais n’entraînent souvent pas une plus grande précision, car des étapes de dilution supplémentaires peuvent être nécessaires. ^[5] La CFU/plaque est lue à partir d’une plaque dans la plage linéaire, puis la CFU/g (ou CFU/mL) de l’original est déduite mathématiquement, en tenant compte de la quantité plaquée et de son facteur de dilution.

L’un des avantages de cette méthode est que différentes espèces microbiennes peuvent donner naissance à des à des colonies qui sont clairement différentes les unes des autres, tant au microscope qu’au microscope. La morphologie de la colonie peut être d’une grande utilité dans l’identification du micro-organisme présent. ^[6]

Une compréhension préalable de l’anatomie microscopique de l’organisme peut permettre de mieux comprendre comment l’UFC/mL observée est liée au nombre de cellules viables par millilitre. Alternativement, il est possible de diminuer le nombre moyen de cellules par UFC dans certains cas en vortex l’échantillon avant de procéder à la dilution. Cependant, de nombreux micro-organismes sont délicats et souffriraient d’une diminution de la proportion de cellules viables lorsqu’elles sont placées dans un vortex. ^[7]

Les

concentrations d’unités formant colonies peuvent être exprimées à l’aide de la notation logarithmique, où la valeur indiquée est le logarithme en base 10 de la concentration. ^{[8] [9] [10]} Cela permet de calculer la réduction logarithmique d’un processus de décontamination comme une simple soustraction.

Utilisations

Les unités formant des colonies sont utilisées pour quantifier les résultats dans de nombreuses méthodes de placage et de comptage microbiologiques, notamment :

• La méthode de la plaque de coulée dans laquelle l’échantillon est suspendu dans une boîte de Pétri à l’aide d’une gélose fondue refroidie à environ 40-45 °C (juste au-dessus du point de solidification pour minimiser la mort cellulaire induite par la chaleur). Une fois que la gélose nutritive s’est solidifiée, la plaque est incubée. ^[11]
• La méthode de la plaque d’épandage dans laquelle l’échantillon (dans un petit volume) est étalé sur la surface d’une plaque de gélose nutritive et laissé sécher avant l’incubation pour le comptage. ^[11]
• Méthode de filtre à membrane dans laquelle l’échantillon est filtré à travers un filtre à membrane, puis le filtre placé à la surface d’une plaque de gélose nutritive. Pendant l’incubation, les nutriments s’infiltrent à travers le filtre pour soutenir les cellules en croissance. Comme la surface de la plupart des filtres est inférieure à celle d’une boîte de Pétri standard, la plage linéaire du comptage des plaques sera moindre. ^[11]
• Les méthodes de Miles et Misra ou la méthode de la plaque de chute dans laquelle une très petite aliquote (généralement environ 10 microlitres) d’échantillon de chaque dilution en série est déposée sur une boîte de Pétri. La boîte de chute doit être lue lorsque les colonies sont très petites pour éviter la perte d’UFC lorsqu’elles grandissent ensemble. ^[12]

Cependant, avec les techniques qui nécessitent l’utilisation d’une plaque de gélose, aucune solution fluide ne peut être utilisée car la pureté de l’échantillon ne peut être inconnue et il n’est pas possible de compter les cellules une par une dans le liquide. ^[13]

Outils pour compter les colonies

Le comptage des colonies est traditionnellement effectué manuellement à l’aide d’un stylo et d’un compteur de clics. Il s’agit généralement d’une tâche simple, mais qui peut devenir très laborieuse et prendre beaucoup de temps lorsqu’il faut dénombrer de nombreuses plaques. Des solutions semi-automatiques (logicielles) et automatiques (matériel + logiciel) peuvent également être utilisées. ^{[14] [15] [16]}

Logiciel de comptage

des UFC Les colonies peuvent être dénombrées à partir d’images de plaques à l’aide d’outils logiciels. Les expérimentateurs prennent généralement une photo de chaque plaque qu’ils doivent compter, puis analysent toutes les images (cela peut être fait avec un simple appareil photo numérique ou même une webcam). Puisqu’il faut moins de 10 secondes pour prendre une seule photo, au lieu de plusieurs minutes pour compter les CFU manuellement, cette approche permet généralement de gagner beaucoup de temps. De plus, il est plus objectif et permet d’extraire d’autres variables telles que la taille et la couleur des colonies. ^[16]

• OpenCFU est un programme gratuit et open-source conçu pour optimiser la convivialité, la vitesse et la robustesse. Il offre une large gamme de filtres et de contrôles ainsi qu’une interface utilisateur moderne. OpenCFU est écrit en C++ et utilise OpenCV pour l’analyse d’images. ^[17]
• NICE est un programme écrit en MATLAB qui permet de compter facilement les colonies à partir d’images. ^[18]
• ImageJ et CellProfiler : Certaines macros et plugins ImageJ ^[19] et certains pipelines CellProfiler ^[20] peuvent être utilisés pour compter les colonies. Cela nécessite souvent L’utilisateur peut modifier le code afin d’obtenir un flux de travail efficace, mais peut s’avérer utile et flexible. L’un des principaux problèmes est l’absence d’interface graphique spécifique qui peut rendre l’interaction avec les algorithmes de traitement fastidieuse.

En plus des logiciels basés sur les ordinateurs de bureau traditionnels, des applications pour les appareils Android et iOS sont disponibles pour le comptage semi-automatisé et automatisé des colonies. La caméra intégrée est utilisée pour prendre des photos de la plaque de gélose et un algorithme interne ou externe est utilisé pour traiter les données d’image et estimer le nombre de colonies. ^{[21] [22] [23] Systèmes}

automatisés

De nombreux systèmes automatisés sont utilisés pour contrer l’erreur humaine, car de nombreuses techniques de recherche effectuées par des humains comptant des cellules individuelles présentent un risque élevé d’erreur. En raison de Le fait que les chercheurs comptent régulièrement manuellement les cellules à l’aide d’une lumière transmise, cette technique sujette aux erreurs, peut avoir un effet significatif sur la concentration calculée dans le milieu liquide principal lorsque les cellules sont en petit nombre. ^[24]

Des systèmes entièrement automatisés sont également disponibles auprès de certains fabricants de biotechnologie. ^{[25] [26]} Ils sont généralement coûteux et ne sont pas aussi flexibles que les logiciels autonomes, car le matériel et le logiciel sont conçus pour fonctionner ensemble pour une configuration spécifique. ^[18] Alternativement, certains systèmes automatiques utilisent le paradigme du placage en spirale. ^[27]

Certains systèmes automatisés, tels que les systèmes de MATLAB, permettent de compter les cellules sans avoir à les colorer. Cela permet aux colonies d’être réutilisées pour d’autres expériences sans risque de tuer les micro-organismes avec des colorants. Cependant, l’inconvénient de ces systèmes automatisés est qu’il est extrêmement difficile de différencier les micro-organismes avec de la poussière ou des rayures sur les plaques de gélose au sang, car la poussière et les rayures peuvent créer une combinaison très diverse de formes et d’apparences. ^[28]

Au

lieu d’unités formant des colonies, les paramètres Nombre le plus probable (NPP) et Unités d’homme-poisson modifiées (UPM) ^[29] peuvent être utilisés. La méthode du nombre le plus probable compte les cellules viables et est utile pour dénombrer de faibles concentrations de cellules ou dénombrer les microbes dans les produits où les particules rendent le comptage sur plaque peu pratique. ^[30] Les unités Fishman modifiées prennent en compte les bactéries qui sont viables, mais non cultivables.

Voir aussi

Références

Pour aller plus loin